基于 GPI 锚连蛋白（CD55 / CD59）的流式细胞术分析
阵发性睡眠性血红蛋白尿症的精准诊断与鉴别
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种获得性造血干细胞克隆性疾病，由 PIG-A 基因突变导致糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚合成障碍，使补体调节蛋白（CD55、CD59）无法锚定于细胞膜，最终引发补体介导的血管内溶血。可发生于任何年龄，以青壮年多见，中位发病年龄约 30-40 岁。
检测红细胞和粒细胞表面 GPI 锚连蛋白表达缺失，灵敏度高、可定量分析 PNH 克隆大小，是目前诊断 PNH 的金标准。可联合 FLAER（荧光嗜气单胞菌毒素）进一步提高特异性。
辅助检查：Ham 试验（酸化血清溶血试验）、糖水试验、蛇毒因子溶血试验等，因灵敏度与特异性不及流式，目前多作为辅助参考。
PNH 克隆的早期检出——在典型溶血症状出现前发现异常克隆
与 AA、MDS 的鉴别诊断——明确疾病本质，避免误诊
克隆大小的动态监测——评估疾病进展与治疗反应
指导靶向治疗——补体抑制剂（依库珠单抗等）用药决策
使用 GPI 连接蛋白（CD55、CD59）的单克隆抗体作为分子探针，与血细胞共同孵育。荧光素 FITC 标记 CD55、PE 标记 CD59，与细胞膜锚连蛋白抗原分子特异性结合。
经流式细胞仪检测，正常人造血细胞 CD55 和 CD59 均为阳性表达。PNH 患者由于细胞表面锚连蛋白部分或完全缺失，呈现 CD55 和/或 CD59 阴性或部分阴性表达。
分析红细胞和粒细胞 GPI 相关抗原的表达量，计数缺乏表达（阴性）的细胞数量。定量评估 PNH 克隆比例，为临床分型和治疗决策提供依据。
根据 GPI 锚连蛋白缺失程度将细胞分为三型：I 型（完全表达/正常）、II 型（部分缺失）、III 型（完全缺失）。PNH 克隆以 II 型和 III 型为主。
EDTA 抗凝全血（EDTA-K₂ 紫头管）
室温放置，避免冷藏或冷冻
24 小时内处理检测
避免溶血和凝块，采集后轻轻颠倒混匀 8-10 次
衰变加速因子 · FITC 绿色荧光
膜反应性溶解抑制物 · PE 橙红荧光
白细胞共同抗原 · PerCP 蓝色荧光
红细胞裂解
稀释与清洗
混匀标本
1500 rpm / 5 min
专用检测管
10μl / 100μl / 1ml
每个血样各取 4 个管，分别标记为 R₁ R₂ W₁ W₂
加入荧光标记抗体进行免疫标记：
混匀后 避光孵育 15 分钟
裂解红细胞，保留白细胞：
混匀后 避光孵育 10 分钟
孵育结束后，对各管进行离心处理：
弃上清时注意不要触碰管底细胞沉淀
对各管细胞沉淀进行洗涤：
洗涤目的：去除残余溶血素、未结合抗体及细胞碎片
洗涤完成后，重悬细胞进行流式检测：
注意避免剧烈吹打导致细胞损伤或产生气泡